Принцип експерименту
Електрофорез гемоглобіну спрямований на виявлення та підтвердження різних нормальних і аномальних гемоглобінів.
Через різні заряди та ізоелектричні точки різних типів гемоглобіну в буферному розчині з певним pH, коли ізоелектрична точка гемоглобіну нижча за pH буферного розчину, гемоглобін несе негативний заряд і мігрує до анода під час електрофорезу. І навпаки, гемоглобін з позитивним зарядом рухається до катода.
Під певною напругою та після певного часу електрофорезу гемоглобіни з різними зарядами та молекулярною масою демонструють різні напрямки та швидкості міграції. Це дозволяє відокремити окремі зони, і подальший колориметричний або електрофоретичний аналіз цих зон можна виконати для кількісного визначення різних гемоглобінів. Найбільш часто використовуваним методом є електрофорез на мембрані з ацетату целюлози при pH 8,6.
У цитоплазмі групи етиленгліколю (CHOH-CHOH), присутні в глікогені або полісахаридних речовинах (таких як мукополісахариди, мукопротеїни, глікопротеїни, гліколіпіди тощо), окислюються періодною кислотою та перетворюються на альдегідні групи (CHO-CHO). Ці альдегідні групи поєднуються з безбарвним пурпурно-червоним реактивом Шиффа, утворюючи пурпурно-червоний барвник, який осідає там, де в клітині присутні полісахариди. Ця реакція відома як фарбування періодичної кислоти-Шиффа (PAS), раніше називалося фарбування глікогену.
Метод експерименту
матеріали:Ацетат целюлозимембран, апарат для електрофорезу(DYCP-38C і блок живлення DYY-6C), Чудовий інструмент завантаження зразків (піпетка), спектрофотометр, колориметричні кювети, буфери.
Буфер:
(1) Буфер TEB з рН 8,6: зважте 10,29 г Трис, 0,6 г EDTA, 3,2 г борної кислоти та додайте дистильовану воду до 1000 мл.
(2) Боратний буфер: зважте 6,87 г бури та 5,56 г борної кислоти та додайте дистильовану воду до 1000 мл.
Процедура:
Pвідновлення розчину гемоглобіну
Візьміть 3 мл крові, що містить гепарин або цитрат натрію як антикоагулянт. Центрифугуйте при 2000 об/хв протягом 10 хвилин і викиньте плазму. Тричі промийте еритроцити фізіологічним розчином (750 об/хв, 5 хвилин центрифугування кожного разу). Центрифугуйте при 2200 об/хв протягом 10 хвилин і видаліть супернатант. Додайте рівну кількість дистильованої води, потім додайте 0,5 об’єму чотирихлористого вуглецю. Енергійно струшуйте протягом 5 хвилин, а потім центрифугуйте при 2200 об/хв протягом 10 хвилин, щоб зібрати верхній розчин Hb для подальшого використання.
Замочування мембрани
Розріжте мембрану з ацетату целюлози на смужки розміром 3 см × 8 см. Замочіть їх у буфері TEB з рН 8,6 до повного насичення, потім вийміть і промокніть фільтрувальним папером.
Плямистість
За допомогою піпетки нанесіть 10 мкл розчину гемоглобіну вертикально на мембрану з ацетату целюлози (шорстка сторона), приблизно на відстані 1,5 см від краю.
Електрофорез
Залийте боратний буферний розчин у камеру для електрофорезу. Розмістіть мембрану з ацетату целюлози стороною з плямами на катодному кінці камери. Попрацювати при 200 В протягом 30 хвилин.
Елюювання
Виріжте зони HbA і HbA2, помістіть їх в окремі пробірки і додайте відповідно 15 мл і 3 мл дистильованої води. Обережно струсіть, щоб повністю видалити гемоглобін, потім перемішайте.
Колориметрія
Обнуліть абсорбцію, використовуючи дистильовану воду для розчину для елюювання, і виміряйте абсорбцію при 415 нм.
Розрахунок
HbA2(%) = абсорбція пробірки HbA2 / (абсорбція пробірки HbA × 5 + абсорбція пробірки HbA2) × 100%
Розрахунок результатів експерименту
Референсний діапазон для pH 8,6 TEB буферний електрофорез з ацетатом целюлози: HbA > 95%, HbA2 1%-3,1%
Примітки
Час електрофорезу не повинно бути занадто довгим. Мембрана з ацетату целюлози не повинна висихати під час електрофорезу. Припиніть електрофорез, коли HbA і HbA2 будуть чітко розділені. Тривалий електрофорез може спричинити дифузію смуг і розмитість.
Уникайте використання занадто великої кількості зразків. Надмірна кількість рідкого гемоглобіну може призвести до відшарування смуги або недостатнього фарбування, що призведе до хибно підвищеного рівня HbA.
Запобігайте забрудненню ацетатцелюлозної мембрани білками.
Струм не повинен бути занадто великим; інакше смуги гемоглобіну можуть не розділятися.
Завжди включайте зразки від нормальних людей і необхідні відомі аномальні гемоглобіни як контроль.
Beijing Liuyi Biotechnology виробляє професійний резервуар для електрофорезу гемоглобіну, який є моделлюDYCP-38Cрезервуар для електрофорезу з мембраною ацетату целюлози, і для резервуара для електрофорезу з мембраною ацетату целюлози доступні дві моделі джерела живлення для електрофорезуDYY-2CіDYY-6Cживлення.
Тим часом Beijing Liuyi Biotechnology надає клієнтам мембрани з ацетату целюлози, і розмір мембрани з ацетату целюлози можна налаштувати. Ласкаво просимо, щоб запитати у нас зразки та додаткову інформацію.
Бренд Beijing Liuyi має більш ніж 50-річну історію в Китаї, і компанія може надавати стабільні та високоякісні продукти по всьому світу. Завдяки рокам розвитку, він гідний вашого вибору!
Зараз ми шукаємо партнерів, вітаємо як резервуар для електрофорезу OEM, так і дистриб’юторів.
Якщо у вас є будь-який план придбання наших продуктів, будь ласка, не соромтеся зв’язатися з нами. Ви можете надіслати нам повідомлення на електронну пошту[електронна пошта захищена]або[електронна пошта захищена], або зателефонуйте нам за номером +86 15810650221 або додайте Whatsapp +86 15810650221 або Wechat: 15810650221
Час публікації: 20 вересня 2023 р