Минулого тижня ми поділилися кількома міркуваннями щодо використання мембранного електрофорезу з ацетату целюлози, і сьогодні завершимо цю тему для вашої довідки.
Вибір Буферна концентрація
Концентрація буфера, яка використовується в електрофорезі з мембраною ацетату целюлози, зазвичай нижча, ніж у паперовому електрофорезі. Зазвичай використовується pH 8,6Bарбітальний буфер зазвичай вибирають у діапазоні від 0,05 моль/л до 0,09 моль/л. При виборі концентрації проводиться попереднє визначення. Наприклад, якщо довжина мембранної смужки між електродами в камері електрофорезу становить 8-10 см, то на 1 сантиметр довжини мембрани потрібна напруга 25 В, а сила струму повинна бути 0,4-0,5 мА на сантиметр ширини мембрани. Якщо ці значення не досягаються або перевищуються під час електрофорезу, концентрацію буфера слід збільшити або розбавити.
Надто низька концентрація буфера призведе до швидкого переміщення смуг і збільшення ширини смуг. З іншого боку, надмірно висока концентрація буфера сповільнить міграцію смуг, що ускладнить розрізнення певних смуг поділу.
Слід зазначити, що при мембранному електрофорезі з ацетату целюлози значна частина струму проходить через зразок, що генерує значну кількість тепла. Іноді вибрану концентрацію буфера можна вважати відповідною. Однак за умов підвищеної температури навколишнього середовища або при використанні високої напруги випаровування води через нагрівання може посилитися, що призведе до надмірно високої концентрації буфера та навіть до висихання мембрани.
Обсяг зразка
При мембранному електрофорезі з ацетату целюлози об’єм зразка визначається різними факторами, включаючи умови електрофорезу, властивості самого зразка, методи фарбування та методи виявлення. Як правило, чим чутливіший метод виявлення, тим меншим може бути об’єм зразка, що є перевагою для розділення. Якщо об’єм зразка надмірний, схеми електрофоретичного розділення можуть бути нечіткими, а фарбування також може зайняти багато часу. Однак під час кількісного аналізу відокремлених пофарбованих смуг за допомогою методів елюційного колориметричного виявлення об’єм зразка не повинен бути надто малим, оскільки це може призвести до нижчих значень поглинання для певних компонентів, що призведе до вищих помилок у розрахунку їх вмісту. У таких випадках об’єм проби слід відповідно збільшити.
Як правило, об’єм зразка, що додається на кожен сантиметр лінії нанесення зразка, становить від 0,1 до 5 мкл, що еквівалентно кількості зразка від 5 до 1000 мкг. Наприклад, під час звичайного електрофорезу сироваткового білка об’єм зразка, доданого на кожен сантиметр лінії нанесення, зазвичай не перевищує 1 мкл, що еквівалентно 60–80 мкг білка. Однак при аналізі ліпопротеїнів або глікопротеїнів за допомогою того самого методу електрофорезу необхідно відповідно збільшити об’єм зразка.
Підсумовуючи, необхідно вибрати найбільш підходящий об’єм зразка на основі конкретних умов шляхом серії попередніх експериментів.
Вибір розчину для фарбування
Відокремлені смуги в електрофорезі мембрани ацетату целюлози зазвичай фарбують перед виявленням. Різні компоненти зразка вимагають різних методів фарбування, і методи фарбування, придатні для електрофорезу на мембрані ацетату целюлози, можуть бути не зовсім застосовними до фільтрувального паперу.
Існує три основних принципи вибору розчину для фарбуваннямембрана з ацетату целюлози. по-перше,Слід віддавати перевагу водорозчинним барвникам перед спирторозчинними, щоб уникнути усадки мембрани та деформації, спричиненої розчином фарбування останнього. Після фарбування важливо промити мембрану водою і мінімізувати тривалість фарбування. В іншому випадку мембрана може скручуватися або зморщуватися, що вплине на подальше виявлення.
По-друге, для зразка бажано вибирати барвники з сильною спорідненістю до фарбування. Під час мембранного електрофорезу сироваткових білків на основі ацетату целюлози зазвичай використовується аміночорний 10B через його сильну спорідненість до різних білкових компонентів сироватки крові та його стабільність.
По-третє, слід вибирати надійні якісні барвники. Деякі барвники, незважаючи на однакову назву, можуть містити домішки, які призводять до особливо темного фону після фарбування. Це може навіть розмити спочатку добре розділені смуги, ускладнюючи їх розрізнення.
Нарешті, важливий вибір концентрації фарбувального розчину. Теоретично може здатися, що більш висока концентрація фарбувального розчину призведе до більш ретельного фарбування компонентів зразка та кращих результатів фарбування. Однак це не так. Спорідненість зв'язування компонентів зразка з барвником має певну межу, яка не зростає зі збільшенням концентрації фарбувального розчину. Навпаки, надмірно висока концентрація фарбувального розчину не тільки витрачає барвник, але й ускладнює отримання чіткого фону. Крім того, коли інтенсивність кольору досягає певного максимального значення, крива поглинання барвника не має лінійної залежності, особливо в кількісних вимірюваннях. При мембранному електрофорезі з ацетату целюлози концентрація фарбувального розчину зазвичай нижча, ніж при електрофорезі паперу.
Подробиці, які варто знати про Beijing Liuyi Biotechnology's мембрана з ацетату целюлозирезервуар для електрофорезу та його застосування для електрофорезу, відвідайте тут:
лЕксперимент із виділення сироваткового білка за допомогою целюлозно-ацетатної мембрани
лЕлектрофорез ацетатцелюлозної мембрани
Якщо у вас є будь-який план придбання наших продуктів, будь ласка, не соромтеся зв’язатися з нами. Ви можете надіслати нам повідомлення на електронну пошту[електронна пошта захищена]або[електронна пошта захищена], або зателефонуйте нам за номером +86 15810650221 або додайте Whatsapp +86 15810650221 або Wechat: 15810650221.
Посилання:Електрофорез (друге видання) пана Лі
Час публікації: 6 червня 2023 р